Hplc%20ref, Chemia(1)
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
1.
W każdej technice chromatograficznej najpierw rozdziela się badaną mieszaninę a następnie
przeprowadza się detekcję poszczególnych składników. Rozdział substancji następuje w
wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę
rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną
Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych
oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu
(fazy ruchomej) przez
fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji
Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne
składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować
ich separacja. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu
retencji
chromatografia cieczowa - w której eluentem jest jakiś ciekły rozpuszczalnik
chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel)
TLC - thin layer chromatography, chromatografia cienkowarstwowa - w której fazę
rozdzielczą stanowi cienka warstwa żelu naniesiona na sztywną płytkę. Na tak
spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił
kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział
mieszaniny
chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły
filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej
chromatografia kolumnowa
- w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej
kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ
roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na
wlocie i wylocie kolumny
chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza
jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec
rozdzielanych substancji;
chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziaływują ze złożem za
pomocą oddziaływań jonowych
8.
chromatografia, w której
jest ciecz, zwykle jakiś rozpuszczalnik. Istotą każdej
chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne związki
chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny przez stałe lub żelowe złoża, co
w pewnym sensie przypomina filtrację.
chromatografia cienkowarstwowa - w której złoże (zwykle żel krzemionkowy) jest
nałożone na płytkę szklaną lub plastikową w formie, cienkiej, sprasowanej formy.
Rozdział następuje poprzez powolne wnikanie roztworu w złoże
chromatografia kolumnowa - w które złoże umieszcza się w kolumnie, po czym przez
kolumnę przepuszcza się roztwór analizowanej mieszaniny - jej szczególnym
przypadkiem jest HPLC
elektroforeza - która w zasadzie jest fomą chromatografii cienkowarstwowej, w której
jednak najpierw nasącza się złoże mieszaniną, a rozdział następuje na skutek działania
pola elektrycznego
3.
9.
Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszanię a
złożem jedne z nich przechodzą przez złoże szybciej a i inne wolniej
HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest
eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atmosfer
Dzięki takiemu ciśnieniu złoże w kolumnach HPLC może być bardziej "upakowane" niż w
kolumnach do zwykłej, niskociśnieniowej chromatografii cieczowej, co powoduje znacznie
lepszy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne, w znacznie
krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eleunta i mniejszej ilości analizowanej próbki
W typowym, analitycznym aparacie HPLC, analiza jednej próbki trwa ok 20 min.
Kolumny HPLC mają przeciętnie długość od 10 cm do 50cm, bywają jednak kolumny
o długości przekraczającej 1m, i przekrój wewnętrzny od 1 do 7-8 mm i mogą być
zestawiane w układy o określonej zdolności rozdzielczej
Do analiz bardzo małych ilości związków chemicznych stosuje się chromatografy
typu nanoHPLC. Kolumny tych chromatografów mają średnicę kilkudziesięciu µm i
długość od kilkunastu do kilkudziesięciu cm. Chromatografy nanoHPLC pracują przy
szybkości przepływu eluenta rzędu kilkuset nl na minutę. Analiza próbki trwa
kilkadziesiąt do kilkuset minut. Chromatografy nanoHPLC charakteryzują się bardzo
dużą rozdzielczościa
Aparaty do preparatywnego HPLC, posiadają kolumny o znacznie większych
przekrojach od aparatów do analitycznego HPLC (rzędu 2-3 cm), co umożliwia
rozdzielanie na nich większych objętości analizowanych substancji - rzędu 1-5 ml
Do opisu mechanizmu retencji w adsorpcyjnych układach faz normalnych stosowany jest
model Snydera – Soczewińskiego. Autorzy tego modelu zakładają konkurencyjność
oddziaływań między powierzchnią adsorbentu (centrami aktywnymi na powierzchni
sorpcyjnej) a cząsteczkami substancji rozdzielanych i cząsteczkami rozpuszczalnika (fazą
ruchomą). Oddziaływania tych substancji z powierzchną adsorbentu są natury dyspersynej
bądź mają miejsce oddziaływania typu dipol-dipol. W warunkach chromatografii analitycznej,
stężenia substancji rozdzielanych są niskie, a powierzchnia adsorbentu pokryta jest
monowarstwą cząsteczek, będących składnikami fazy ruchomej, a retencja rozdzielanych
substancji jest efektem wypierania cząsteczek fazy ruchomej z powierzchni adsorbentu przez
cząsteczki rozdzielanych substancji i zajęciem ich miejsca lub wynikiem asocjacji cząsteczek
substancji w warstwie rozpuszczalnikaW przypadku asocjacji, cząsteczka
"chromatografowanej" substancji usuwa w przybliżeniu równoważną objętość fazy ruchomej
z warstwy podwójnej rozpuszczalnika zaadsorbowanego na powierzchni fazy stacjonarnej,
czyniąc dostęp do "odkrytego" centrum aktywnego
Model Snydera - Soczewińskiego dotyczy rozdzielania substancji nie polarnych i słabo
polarnych, gdy cząsteczki substancji i cząsteczki fazy ruchomej są jednakowo traktowane
przez adsorbent i nie wykazują "chęci" do
zlokalizowanej adsorpcji,
czyli mogą swobodnie
przemieszczać się na powierzchni adsorbentu. Gdy polamość powierzchni sorpcyjnej wzrasta,
zarówno cząsteczki substancji rozdzielanych, jaki i cząsteczki rozpuszczalnika są silnie
przyciągane przez polarne grupy (centra aktywne) na powierzchni fazy stacjonarnej (patrz
rys. 2.1), a oddziaływania cząsteczek substancji i cząsteczek fazy ruchomej z adsorbentem są
specyficzne i nie są identyczne. Można to wyjaśnić następująco: cząsteczki substancji
polarnych adsorbują się bezpośrednio na preferowanym miejscu adsorbentu np. w przypadku
żelu krzemionkowego tymi miejscami są grupy -OH, a siła oddziaływań zależy od polamości
zaadsarbowanej grupy. Wówczas występuje zlokalizowana adsorpcja. Jeżeli
"chromatografowane" substancje posiadają dwie lub więcej grupy polarne, to nie ma
możliwości by każda z grup mogła adsorbować się w tym samym czasie i tylko jedna z grup
polarnych jest zlokalizowana na powierzchni adsorbentu. Również zlokalizowana adsorpcja
bardzo polarnego rozpuszczalnika jest możliwa, co ma duże konsekwencje praktyczne, gdyż
może następować zmiana selektywności układu chromatograficznego, na skutek ciągłej
zmiany składu fazy ruchomej. Cząsteczki polarne i polarny składnik fazy ruchomej silnie
współzawodniczą o miejsce na powierzchni adsorbentu zatem, retencja i selektywność zależą
od zawartości polarnego składnika w fazie ruchomej.
Powyższy opis adsorpcji wyjaśnia dlaczego układy adsorpcyjne są tak bardzo wrażliwe
na obecność polarnego składnika w fazie ruchomej tzw.
moderatora.
Najbardziej
powszechnym moderatorem jest woda, niestety - przysparzającym wielu kłopotów w
adsorbcyjnych układach faz normalnych. Nawet niewielka zawartość wody w niepolarnym
rozpuszczalniku uważanym za bezwodny, np. w heksanie, drastycznie zmienia retencję
rozdzielanych substancji na skutek zmiany selektywności układu chromatograficznego. W
skrajnych wypadkach może nastąpić całkowita dezaktywacja fazy stacjonarnej i utrata
możliwości adsorpcji. (Trzeba mieć świadomość, że wówczas może zaczynać zachodzić
podział do "warstewki" wody).
Z przedstawionych zjawisk wynika, że w doborze składnika polarnego w fazie ruchomej
kierujemy się nie tylko polarnością rozpuszczalnika, ale i jego zdolnością do zlokalizowanej
adsorpcji.
Fazu odwrocone
Nazwa ukłąd faz odwroconych jest nazwą zwyczajową, wynikającą z historii rozwoju
chromatografii cieczowej. W poczatkowym okresie stosowania technik chromatograficznych
fazami stacjonarnymi byly polarne sorbenty natomiast fazami ruchomymi rozpuszczalniki
mniej polarne
3.2. FAZY STACJONARNE.
Przez wiele lat niepolame fazy stacjonarne były otrzymywane przez nanoszenie
substancji niepolamej, o dużej lepkości, w sposób fizyczny na nośnik, np przez impregnację
bibuły celulozowej olejem parafinowym. Fazy takie miały wiele wad, a najważniejszą z nich
były problemy z uzyskaniem dobrej odtwarzalności własności retencyjnych i tym samym
odtwarzalności parametrów chromatograficznych. Jedną z przyczyn było wymywanie fazy
stacjonarnej z nośnika w trakcie elucji. Prace nad usprawnieniem procesu doprowadziły do
powstania nowej generacji faz stacjonarnych, nazwanych fazami związanymi. Otrzymuje się
je w wyniku modyfikacji powierzchni sorbentów, najczęściej polarnych, nie polarnymi, albo
średnio polarnymi cząsteczkami fazy stacjonarnej, chemicznie związanymi z cząsteczkami
powierzchni "nośnika". Materiałem wyjściowym, powszechnie jeszcze stosowanym do
produkcji faz związanych, jest żel krzemionkowy, ale wykorzystuje się też tlenek glinu, di-
tlenek tytanu, cyrkonu, albo polimery organiczne (kopolimer styrenu i diwinylobenzenu, albo
poliamidy, lub polimetakrylany i inne).
Własności powierzchniowe żelu krzemionkowego zostały opisane w części dotyczącej
chromatograficznych układów faz normalnych. W celu otrzymania fazy związanej o dobrych
własnościach powierzchniowych z wykorzystaniem żelu krzemionkowego, stężenie grup -OH
ma powierzchni porowatej "krzemionki" powinno wynosić 7-8 umoli/m
2
. Ważna jest również
chemiczna czystość żelu krzemionkowego, ponieważ obecność metali powoduje wzrost kwa-
sowości grup -OH. Grupy -OH, pozostałe na powierzchni sorpcyjnej powodują
niejednorodność właściwości powierzchni sorpcyjnej faz związanych, szczególnie wyraźną,
gdy są to grupy o podwyższonej aktywności, powstałej w wyniku aktywacji przez jony
metali.
Otrzymywanie żelu krzemionkowego o odpowiedniej granulacji, porowatości, powierzchni
właściwej oraz strukturze powierzchniowej jest dobrze opanowane. Adsorbent ten jest od
dziesięcioleci stosowany w chromatografii. Istnieje grupa producentów oferujących materiał o
odpowiednich parametrach. Wadą żelu krzemionkowego jest względnie duża jego
rozpuszczalność w wodzie, gwałtownie wzrastająca w roztworach o pH > 7, z powodu
wzrostu szybkości hydrolizy wiązań siloksanowych na powierzchni żelu krzemionkowego.
Otrzymywanie niepolarnych faz związanych opiera się na reakcji powierzchniowych
grup OH z odpowiednimi silanami. Reakcję z monochlorosilanem można przedstawić w
uproszczeniu za pomocą równania:
- Si - OH(na powierzchni żelu) + (CH,), R Si Cl -* - Si - O - Si (CH,), R (na powierzchni
żelu) + HC1
R jest łańcuchem węglowodorowym (C 18, C8, C4, grupą fenylową, alkilo-difenylową
itp.), albo inną grupą funkcyjną (alkilonitryl, alkiloamina, aklilodiol itp.), decydującą o
charakterze i właściwościach powierzchni otrzymanego sorbentu. Jest to przykład fazy
"monomery-cznej", w której z jednym atomu krzemu związana jest jedna cząsteczka silanu.
W otrzymanej w ten sposób fazie stacjonarnej stosowanej w układzie faz odwróconych,
zamiast grup OH, o charakterze kwasowym, na powierzchni znajdują się niepolarae łańcuchy
węglowodorowe, ewentualnie alkilonitrylowe, albo podobne. Powierzchnia jest tym bardziej
hydrofobowa, im większy jest stopień pokrycia niepolamą fazą stacjonarną oraz im więcej
atomów węgla zawiera łańcuch węglowodorowy.
W przypadku zastosowania silanu z trzema grupami aktywnymi, np. trichlorosilanu,
zależnie od warunków prowadzenia reakcji, można otrzymać warstwy, monomeryczne lub
spolimeryzowane, usieciowane przestrzennie poprzez wiązania siloksanowe.
Grubość i struktura organicznej warstwy zależy od liczby i rozmieszczenia grup -OH na
"wyjściowej" powierzchni żelu, chemicznej natury silanu oraz warunków reakcji. Warstwy
monomeryczne mają lepiej zdefiniowaną powierzchnię. W tego typu fazach łatwiej jest też
uzyskać powtarzalność własności powierzchniowych w kolejnych seńach produkcyjnych.
Hydrofobowość powierzchni zależy więc od natury silanu oraz od stopnia pokrycia fazą
węglowodorową. Idealnym stanem byłoby związanie wszystkich powierzchniowych grup
-OH. W praktyce jest to nieosiągalne. Ze względu na przeszkody sferyczne, nie wszystkie
grupy OH mogą przereagować z dużą cząsteczką chloroalkilosilanu (najczęściej
oktadecylosilanu, a w przypadku najsilniej hydrofobowych faz stacjonarnych, łańcuch
węglowodorowy może liczyć nawet 30 atomów węgla). Ponadto, w przypadku użycia
trichloroalkilosilanu, w wyniku hydrolizy, pozostałe atomy chloru podstawiane są grupami
-OH. Nawet w przypadku faz spolimeryzowanych, jeżeli nie dochodzi do pełnego
usieciowania, pozostaje pewna liczba grup -OH.
Obecność polarnych grup aktywnych na powierzchni zasadniczo niepolamej może
prowadzić do mieszanego mechanizmu adsorpcji, którego skutkiem jest "ogonowanie" pików
substancji polarnych, szczególnie tych o charakterze zasadowym. Usunięcia większości tych
grup dokonuje się przez przeprowadzenie następnej reakcji z monochlorosilanem, najczęściej
trimetylochlorosilanem. W efekcie uzyskuje się bardziej jednorodną powierzchnię. Grupy
-OH, które nie przereagowały z małymi cząsteczkami silanu w drugim etapie, będą również
trudno dostępne dla innych cząsteczek, ich wpływ na retencję związków nie będzie
zauważalny.
W niektórych przypadkach dotyczących mieszanin substancji polarnych faza
zawierająca na powierzchni grupy polarne polepsza selektywność rozdzielania.
Doświadczenie wykazało, że lepsze efekty rozdzielania związków polarnych uzyskuje się na
fazach, których grupy polarne są mniej aktywne niż powierzchniowe grupy -OH. W ostatnich
latach opracowano nowy rodzaj faz związanych, w których w łańcuchu alifatycznym, na ogół
przy trzecim węglu, licząc od wiązania łańcucha węglowodorowego z powierzchnią sorbentu,
znajduje się grupa polarna, najczęściej amidowa.
O
l II - Si- O- Si- CH^CaCHr-N- C- CH,(CH,)„CH,
H
Mimo, że możliwości są olbrzymie, w praktyce stosowanych jest kilka rodzajów
wypełnień. Niektóre z nich zestawiono w tabeli 3.1.
Fazy związane wyprodukowane na bazie żelu krzemionkowego są trwałe w pewnym
przedziale pH, zazwyczaj 2-8, często jednak 2,5 - 7,5. Przy pH < 2 następuje wymywanie
fazy związanej z kolumny wskutek rozerwania wiązania siloksanowego (hydrolizy),
natomiast przy pH > 7, zaczyna mieć miejsce rozpuszczanie się żelu. Z praktycznego punktu
widzenia jest to
niewygodne ograniczenie, szczególnie górna granica pH wynosząca 7,5 - 8 utrudnia
analizę niektórych substancji o charakterze zasadowym. Fazy związane zawierające
węglowodory o krótkich łańcuchach są mniej stabilne przy niskich wartościach pH niż fazy
długołańcuchowe. Zwiększoną odporność na graniczne wartości pH wykazują fazy
polimeryczne w porównaniu z monomery cznymi. Otrzymano też fazy chronione sterycznie,
w których zamiast grupy metylenowej w pozycji Rl (patrz rys. 3.1) wprowadzone są grupy o
większych cząsteczkach, np. -CH2CH(CH3);, utrudniające hydrolizę wiązania Si-O-Si lub
oddziaływanie z grupami -OH. Inną grupę stanowią fazy, w których powierzchniowe grupy
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
zanotowane.pl doc.pisz.pl pdf.pisz.pl chiara76.opx.pl
1.
W każdej technice chromatograficznej najpierw rozdziela się badaną mieszaninę a następnie
przeprowadza się detekcję poszczególnych składników. Rozdział substancji następuje w
wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę
rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną
Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych
oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu
(fazy ruchomej) przez
fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji
Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne
składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować
ich separacja. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu
retencji
chromatografia cieczowa - w której eluentem jest jakiś ciekły rozpuszczalnik
chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel)
TLC - thin layer chromatography, chromatografia cienkowarstwowa - w której fazę
rozdzielczą stanowi cienka warstwa żelu naniesiona na sztywną płytkę. Na tak
spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił
kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział
mieszaniny
chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły
filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej
chromatografia kolumnowa
- w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej
kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ
roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na
wlocie i wylocie kolumny
chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza
jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec
rozdzielanych substancji;
chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziaływują ze złożem za
pomocą oddziaływań jonowych
8.
chromatografia, w której
jest ciecz, zwykle jakiś rozpuszczalnik. Istotą każdej
chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne związki
chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny przez stałe lub żelowe złoża, co
w pewnym sensie przypomina filtrację.
chromatografia cienkowarstwowa - w której złoże (zwykle żel krzemionkowy) jest
nałożone na płytkę szklaną lub plastikową w formie, cienkiej, sprasowanej formy.
Rozdział następuje poprzez powolne wnikanie roztworu w złoże
chromatografia kolumnowa - w które złoże umieszcza się w kolumnie, po czym przez
kolumnę przepuszcza się roztwór analizowanej mieszaniny - jej szczególnym
przypadkiem jest HPLC
elektroforeza - która w zasadzie jest fomą chromatografii cienkowarstwowej, w której
jednak najpierw nasącza się złoże mieszaniną, a rozdział następuje na skutek działania
pola elektrycznego
3.
9.
Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszanię a
złożem jedne z nich przechodzą przez złoże szybciej a i inne wolniej
HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest
eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atmosfer
Dzięki takiemu ciśnieniu złoże w kolumnach HPLC może być bardziej "upakowane" niż w
kolumnach do zwykłej, niskociśnieniowej chromatografii cieczowej, co powoduje znacznie
lepszy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne, w znacznie
krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eleunta i mniejszej ilości analizowanej próbki
W typowym, analitycznym aparacie HPLC, analiza jednej próbki trwa ok 20 min.
Kolumny HPLC mają przeciętnie długość od 10 cm do 50cm, bywają jednak kolumny
o długości przekraczającej 1m, i przekrój wewnętrzny od 1 do 7-8 mm i mogą być
zestawiane w układy o określonej zdolności rozdzielczej
Do analiz bardzo małych ilości związków chemicznych stosuje się chromatografy
typu nanoHPLC. Kolumny tych chromatografów mają średnicę kilkudziesięciu µm i
długość od kilkunastu do kilkudziesięciu cm. Chromatografy nanoHPLC pracują przy
szybkości przepływu eluenta rzędu kilkuset nl na minutę. Analiza próbki trwa
kilkadziesiąt do kilkuset minut. Chromatografy nanoHPLC charakteryzują się bardzo
dużą rozdzielczościa
Aparaty do preparatywnego HPLC, posiadają kolumny o znacznie większych
przekrojach od aparatów do analitycznego HPLC (rzędu 2-3 cm), co umożliwia
rozdzielanie na nich większych objętości analizowanych substancji - rzędu 1-5 ml
Do opisu mechanizmu retencji w adsorpcyjnych układach faz normalnych stosowany jest
model Snydera – Soczewińskiego. Autorzy tego modelu zakładają konkurencyjność
oddziaływań między powierzchnią adsorbentu (centrami aktywnymi na powierzchni
sorpcyjnej) a cząsteczkami substancji rozdzielanych i cząsteczkami rozpuszczalnika (fazą
ruchomą). Oddziaływania tych substancji z powierzchną adsorbentu są natury dyspersynej
bądź mają miejsce oddziaływania typu dipol-dipol. W warunkach chromatografii analitycznej,
stężenia substancji rozdzielanych są niskie, a powierzchnia adsorbentu pokryta jest
monowarstwą cząsteczek, będących składnikami fazy ruchomej, a retencja rozdzielanych
substancji jest efektem wypierania cząsteczek fazy ruchomej z powierzchni adsorbentu przez
cząsteczki rozdzielanych substancji i zajęciem ich miejsca lub wynikiem asocjacji cząsteczek
substancji w warstwie rozpuszczalnikaW przypadku asocjacji, cząsteczka
"chromatografowanej" substancji usuwa w przybliżeniu równoważną objętość fazy ruchomej
z warstwy podwójnej rozpuszczalnika zaadsorbowanego na powierzchni fazy stacjonarnej,
czyniąc dostęp do "odkrytego" centrum aktywnego
Model Snydera - Soczewińskiego dotyczy rozdzielania substancji nie polarnych i słabo
polarnych, gdy cząsteczki substancji i cząsteczki fazy ruchomej są jednakowo traktowane
przez adsorbent i nie wykazują "chęci" do
zlokalizowanej adsorpcji,
czyli mogą swobodnie
przemieszczać się na powierzchni adsorbentu. Gdy polamość powierzchni sorpcyjnej wzrasta,
zarówno cząsteczki substancji rozdzielanych, jaki i cząsteczki rozpuszczalnika są silnie
przyciągane przez polarne grupy (centra aktywne) na powierzchni fazy stacjonarnej (patrz
rys. 2.1), a oddziaływania cząsteczek substancji i cząsteczek fazy ruchomej z adsorbentem są
specyficzne i nie są identyczne. Można to wyjaśnić następująco: cząsteczki substancji
polarnych adsorbują się bezpośrednio na preferowanym miejscu adsorbentu np. w przypadku
żelu krzemionkowego tymi miejscami są grupy -OH, a siła oddziaływań zależy od polamości
zaadsarbowanej grupy. Wówczas występuje zlokalizowana adsorpcja. Jeżeli
"chromatografowane" substancje posiadają dwie lub więcej grupy polarne, to nie ma
możliwości by każda z grup mogła adsorbować się w tym samym czasie i tylko jedna z grup
polarnych jest zlokalizowana na powierzchni adsorbentu. Również zlokalizowana adsorpcja
bardzo polarnego rozpuszczalnika jest możliwa, co ma duże konsekwencje praktyczne, gdyż
może następować zmiana selektywności układu chromatograficznego, na skutek ciągłej
zmiany składu fazy ruchomej. Cząsteczki polarne i polarny składnik fazy ruchomej silnie
współzawodniczą o miejsce na powierzchni adsorbentu zatem, retencja i selektywność zależą
od zawartości polarnego składnika w fazie ruchomej.
Powyższy opis adsorpcji wyjaśnia dlaczego układy adsorpcyjne są tak bardzo wrażliwe
na obecność polarnego składnika w fazie ruchomej tzw.
moderatora.
Najbardziej
powszechnym moderatorem jest woda, niestety - przysparzającym wielu kłopotów w
adsorbcyjnych układach faz normalnych. Nawet niewielka zawartość wody w niepolarnym
rozpuszczalniku uważanym za bezwodny, np. w heksanie, drastycznie zmienia retencję
rozdzielanych substancji na skutek zmiany selektywności układu chromatograficznego. W
skrajnych wypadkach może nastąpić całkowita dezaktywacja fazy stacjonarnej i utrata
możliwości adsorpcji. (Trzeba mieć świadomość, że wówczas może zaczynać zachodzić
podział do "warstewki" wody).
Z przedstawionych zjawisk wynika, że w doborze składnika polarnego w fazie ruchomej
kierujemy się nie tylko polarnością rozpuszczalnika, ale i jego zdolnością do zlokalizowanej
adsorpcji.
Fazu odwrocone
Nazwa ukłąd faz odwroconych jest nazwą zwyczajową, wynikającą z historii rozwoju
chromatografii cieczowej. W poczatkowym okresie stosowania technik chromatograficznych
fazami stacjonarnymi byly polarne sorbenty natomiast fazami ruchomymi rozpuszczalniki
mniej polarne
3.2. FAZY STACJONARNE.
Przez wiele lat niepolame fazy stacjonarne były otrzymywane przez nanoszenie
substancji niepolamej, o dużej lepkości, w sposób fizyczny na nośnik, np przez impregnację
bibuły celulozowej olejem parafinowym. Fazy takie miały wiele wad, a najważniejszą z nich
były problemy z uzyskaniem dobrej odtwarzalności własności retencyjnych i tym samym
odtwarzalności parametrów chromatograficznych. Jedną z przyczyn było wymywanie fazy
stacjonarnej z nośnika w trakcie elucji. Prace nad usprawnieniem procesu doprowadziły do
powstania nowej generacji faz stacjonarnych, nazwanych fazami związanymi. Otrzymuje się
je w wyniku modyfikacji powierzchni sorbentów, najczęściej polarnych, nie polarnymi, albo
średnio polarnymi cząsteczkami fazy stacjonarnej, chemicznie związanymi z cząsteczkami
powierzchni "nośnika". Materiałem wyjściowym, powszechnie jeszcze stosowanym do
produkcji faz związanych, jest żel krzemionkowy, ale wykorzystuje się też tlenek glinu, di-
tlenek tytanu, cyrkonu, albo polimery organiczne (kopolimer styrenu i diwinylobenzenu, albo
poliamidy, lub polimetakrylany i inne).
Własności powierzchniowe żelu krzemionkowego zostały opisane w części dotyczącej
chromatograficznych układów faz normalnych. W celu otrzymania fazy związanej o dobrych
własnościach powierzchniowych z wykorzystaniem żelu krzemionkowego, stężenie grup -OH
ma powierzchni porowatej "krzemionki" powinno wynosić 7-8 umoli/m
2
. Ważna jest również
chemiczna czystość żelu krzemionkowego, ponieważ obecność metali powoduje wzrost kwa-
sowości grup -OH. Grupy -OH, pozostałe na powierzchni sorpcyjnej powodują
niejednorodność właściwości powierzchni sorpcyjnej faz związanych, szczególnie wyraźną,
gdy są to grupy o podwyższonej aktywności, powstałej w wyniku aktywacji przez jony
metali.
Otrzymywanie żelu krzemionkowego o odpowiedniej granulacji, porowatości, powierzchni
właściwej oraz strukturze powierzchniowej jest dobrze opanowane. Adsorbent ten jest od
dziesięcioleci stosowany w chromatografii. Istnieje grupa producentów oferujących materiał o
odpowiednich parametrach. Wadą żelu krzemionkowego jest względnie duża jego
rozpuszczalność w wodzie, gwałtownie wzrastająca w roztworach o pH > 7, z powodu
wzrostu szybkości hydrolizy wiązań siloksanowych na powierzchni żelu krzemionkowego.
Otrzymywanie niepolarnych faz związanych opiera się na reakcji powierzchniowych
grup OH z odpowiednimi silanami. Reakcję z monochlorosilanem można przedstawić w
uproszczeniu za pomocą równania:
- Si - OH(na powierzchni żelu) + (CH,), R Si Cl -* - Si - O - Si (CH,), R (na powierzchni
żelu) + HC1
R jest łańcuchem węglowodorowym (C 18, C8, C4, grupą fenylową, alkilo-difenylową
itp.), albo inną grupą funkcyjną (alkilonitryl, alkiloamina, aklilodiol itp.), decydującą o
charakterze i właściwościach powierzchni otrzymanego sorbentu. Jest to przykład fazy
"monomery-cznej", w której z jednym atomu krzemu związana jest jedna cząsteczka silanu.
W otrzymanej w ten sposób fazie stacjonarnej stosowanej w układzie faz odwróconych,
zamiast grup OH, o charakterze kwasowym, na powierzchni znajdują się niepolarae łańcuchy
węglowodorowe, ewentualnie alkilonitrylowe, albo podobne. Powierzchnia jest tym bardziej
hydrofobowa, im większy jest stopień pokrycia niepolamą fazą stacjonarną oraz im więcej
atomów węgla zawiera łańcuch węglowodorowy.
W przypadku zastosowania silanu z trzema grupami aktywnymi, np. trichlorosilanu,
zależnie od warunków prowadzenia reakcji, można otrzymać warstwy, monomeryczne lub
spolimeryzowane, usieciowane przestrzennie poprzez wiązania siloksanowe.
Grubość i struktura organicznej warstwy zależy od liczby i rozmieszczenia grup -OH na
"wyjściowej" powierzchni żelu, chemicznej natury silanu oraz warunków reakcji. Warstwy
monomeryczne mają lepiej zdefiniowaną powierzchnię. W tego typu fazach łatwiej jest też
uzyskać powtarzalność własności powierzchniowych w kolejnych seńach produkcyjnych.
Hydrofobowość powierzchni zależy więc od natury silanu oraz od stopnia pokrycia fazą
węglowodorową. Idealnym stanem byłoby związanie wszystkich powierzchniowych grup
-OH. W praktyce jest to nieosiągalne. Ze względu na przeszkody sferyczne, nie wszystkie
grupy OH mogą przereagować z dużą cząsteczką chloroalkilosilanu (najczęściej
oktadecylosilanu, a w przypadku najsilniej hydrofobowych faz stacjonarnych, łańcuch
węglowodorowy może liczyć nawet 30 atomów węgla). Ponadto, w przypadku użycia
trichloroalkilosilanu, w wyniku hydrolizy, pozostałe atomy chloru podstawiane są grupami
-OH. Nawet w przypadku faz spolimeryzowanych, jeżeli nie dochodzi do pełnego
usieciowania, pozostaje pewna liczba grup -OH.
Obecność polarnych grup aktywnych na powierzchni zasadniczo niepolamej może
prowadzić do mieszanego mechanizmu adsorpcji, którego skutkiem jest "ogonowanie" pików
substancji polarnych, szczególnie tych o charakterze zasadowym. Usunięcia większości tych
grup dokonuje się przez przeprowadzenie następnej reakcji z monochlorosilanem, najczęściej
trimetylochlorosilanem. W efekcie uzyskuje się bardziej jednorodną powierzchnię. Grupy
-OH, które nie przereagowały z małymi cząsteczkami silanu w drugim etapie, będą również
trudno dostępne dla innych cząsteczek, ich wpływ na retencję związków nie będzie
zauważalny.
W niektórych przypadkach dotyczących mieszanin substancji polarnych faza
zawierająca na powierzchni grupy polarne polepsza selektywność rozdzielania.
Doświadczenie wykazało, że lepsze efekty rozdzielania związków polarnych uzyskuje się na
fazach, których grupy polarne są mniej aktywne niż powierzchniowe grupy -OH. W ostatnich
latach opracowano nowy rodzaj faz związanych, w których w łańcuchu alifatycznym, na ogół
przy trzecim węglu, licząc od wiązania łańcucha węglowodorowego z powierzchnią sorbentu,
znajduje się grupa polarna, najczęściej amidowa.
O
l II - Si- O- Si- CH^CaCHr-N- C- CH,(CH,)„CH,
H
Mimo, że możliwości są olbrzymie, w praktyce stosowanych jest kilka rodzajów
wypełnień. Niektóre z nich zestawiono w tabeli 3.1.
Fazy związane wyprodukowane na bazie żelu krzemionkowego są trwałe w pewnym
przedziale pH, zazwyczaj 2-8, często jednak 2,5 - 7,5. Przy pH < 2 następuje wymywanie
fazy związanej z kolumny wskutek rozerwania wiązania siloksanowego (hydrolizy),
natomiast przy pH > 7, zaczyna mieć miejsce rozpuszczanie się żelu. Z praktycznego punktu
widzenia jest to
niewygodne ograniczenie, szczególnie górna granica pH wynosząca 7,5 - 8 utrudnia
analizę niektórych substancji o charakterze zasadowym. Fazy związane zawierające
węglowodory o krótkich łańcuchach są mniej stabilne przy niskich wartościach pH niż fazy
długołańcuchowe. Zwiększoną odporność na graniczne wartości pH wykazują fazy
polimeryczne w porównaniu z monomery cznymi. Otrzymano też fazy chronione sterycznie,
w których zamiast grupy metylenowej w pozycji Rl (patrz rys. 3.1) wprowadzone są grupy o
większych cząsteczkach, np. -CH2CH(CH3);, utrudniające hydrolizę wiązania Si-O-Si lub
oddziaływanie z grupami -OH. Inną grupę stanowią fazy, w których powierzchniowe grupy
[ Pobierz całość w formacie PDF ]